FNsP Bratislava, pracovisko Staré mesto
CENTRUM LEKÁRSKEJ GENETIKY
úsek molekulovej a biochemickej genetickej diagnostiky
Mickiewiczova 13, 813 69 Bratislava 1 tel: 02/57290 192 (689)
MOLEKULOVO GENETICKÉ VY?ETRENIA
- Duchennova/Beckerova svalová dystrofia (detekcia delécií v dystrofínovom géne) [multiplex PCR] (8)
- Turnerov syndrom (detekcia prítomnosti Y ?pecifických sekvencií) [PCR] (8)
- Detekcia prítomnosti X a Y ?pecifických sekvencií [PCR] (8)
- Detekcia mikrodelécií Y chromozómu u pacientov s poruchami plodnosti [PCR] (8)
- Kongenitálna adrenálna hyperplázia [nested PCR, sekvenčná analýza génu pomocou genetického analyzéra ABI 310] (8)
- Familiárny defekt ApoB-100 -detekcia mutácie R3500Q [ACRS/RFLP] (6)
- Izoformy Apolipoproteinu E - genotypizácia (APOE2, APOE3, APOE4) [PCR/RFLP] (6)
- Deficiencia acyl-CoA dehydrogenázy pre stredne dlhé reťazce (MCAD) - detekcia mutácie 985A®G [ACRS/RFLP, sekvenčná analýza 11.exónu pomocou genetického analyzéra ABI 310] (6)
- MTHFR (677C®T) - polymorfismus génu pre 5,10 metyléntetrahydrofolát reduktázu [PCS/RFLP] (6)
- X-adrenoleukodystrofia [sekvenčná analýza génu ABCD1 pomocou genetického analyzéra ABI 310] (5)
- Defekt myoadenylát deaminázy AMPD1 - detekcia mutácie 34C®T [PCR/RFLP] (6)
- PPARg2 (34C®G) - polymorfismus génu pre jadrový receptor aktivovaný peroxizómovým proliferátorom [ACRS/RFLP] (6)
- Hereditárna hemochromatóza (HC) (C282Y, H63D, S65C) [PCR/RFLP] (6)
- APC resistencia (antikoagulačný proetin C) - mutácia faktoru V Leiden (1691G®A) [PCR/RFLP] (6)
- Protrombínový génový variant 20210G®A [PCR/RFLP] (6)
- Cytochrom P-450 CYP2C9 polymorfismus - detekcia alel CYP2C9*1, CYP2C9*2,CYP2C9*3 [ACRS/RFLP] (6)
- Mutácia génu pre peroxizómový membránový protein PEX1 (G843D a c2097-2098insT) [sekvenčná analýza pomocou genetického analyzéra ABI 310]
- Smith-Lemli-Opitz syndrom (SLOS) [sekvenčná analýza génu 7DCHR pomocou genetického analyzéra ABI 310] (5)(6)
- Gilbertov syndróm - deficiencia bilirubin UDP-glukuronyltransferázy spôsobená polymorfismom (TA)n v promótore génu UGT1A1 [fragmentačná analýza, fluorescenčne značená PCR genetický analyzér ABI 310] (6)
- Canavanova choroba (deficiencia aspartoacyclásy) [sekvenčná analýza génu ASPA pomocou genetického analyzéra ABI 310] (6)
- Hereditárna intolerancia fruktózy (deficiencia fruktóza-1,6-bifosfát aldolázy) [sekvenčná analýza génu ALDOB pomocou genetického analyzéra ABI 310] (6)
- Deficiencia hydroxyacyl-CoA dehydrogenázy pre dlhé reťazce (LCHAD) - detekcia mutácie 1528G®C [PCR/RFLP] (6)
- Fragilný X syndróm - fragmentačná analýza génu FRAXA [fluorescenčne značená PCR genetický analyzér ABI 310] (6)
- Prader-Willi/Angelman syndróm [metylačná PCR/RFLP] (6)
- Presenilín1 [sekvenčná analýza génu PS1 pomocou genetického analyzéra ABI 310] (5)
- Presenilín2 [sekvenčná analýza génu PS2 pomocou genetického analyzéra ABI 310] (5)
- Mikrotubulárny asociovaný protein tau [sekvenčná analýza exónov 9.,10.,11. MAPT génu pomocou genetického analyzéra ABI 310] (6)
- Amyloidový prekurzorový protein [sekvenčná analýza exónov 16.,17. APP génu pomocou genetického analyzéra ABI 310] (6)
Informácia o molekulovo genetických vy?etreniach a indikačné kritéria
Familiárny defekt Apolipoproteinu B-100
Indikácia: familiárna hypercholesterolemia
Familiárny defekt Apolipoproteinu B-100 - (FDB-100) je autosomálne dominantné ochorenie, pri ktorom zistený nález zvý?ených hladín aterogénnych lipoproteinov LDL mo?no klasifikovať ako familiárnu hypercholesterolemiu (FH). V dôsledku zámeny bázy v kodóne pre AMK v pozícii 3500 dochádza pri syntéze apoB-100 k substitúcii arginínu za glutamín (R3500Q), čím sa výrazne zni?uje schopnosť apolipoproteinu viazať na LDL receptor. Molekulárno genetické vy?etrenie je zalo?ené na metóde PCR, pri ktorej mo?no spoľahlivo odlí?iť mutovaný gén od normálneho a tým potvrdiť diagnózu FDB-100. Vy?etrenie je indikované u pacientov mlad?ích ako 30 rokov pri hladinách celkového choloesterolu vy??ích ako 7-8 mmol/l. U pacientov star?ích ako 30 rokov pri hladinách celkového choloesterolu vy??ích ako 8-9 mmol/l.
Izoformy Apolipoproteinu E - (Apo-E)
Indikácia: Alzheimerova choroba (AD), hyperlipoproteinemia III (dysbetalipoproteinemia), predčasný aterosklerotický proces
Apo-E je polymorfný proteín s rôznou distribúciou jeho isoforiem v lipoproteinoch. Jeho hlavnou funkciou je sprostredkovanie interakcie medzi chylomikrónovými a VLDL remnantami a lipoproteinovými receptormi. Existujú 3 hlavné formy (alely) génu kódujúceho Apo-E: e2, e3, e4. Ich kombináciou vzniká 6 mo?ných genotypov s nasledujúcou frekvenciou v európskej populácii: e2/e2 - 1%, e2/e3 - 15%, e2/e4 - 3%, e3/e3 - 56%, e3/e4 - 23%, e4/e4 - 2%. Predpokladá sa, ?e Apo-B e4 sa podieľa 30-50% na genetickom riziku Alzheimerovej choroby. Analýza korelácie polymorfizmov a AD ukázala, ?e u pacientov s AD je podstatne zvý?ený výskyt e4 (pribli?ne 40%). Pacienti homozygotní pre e4 alelu majú skor?í nástup ochorenia ako pacienti heterozygotní. Naopak prítomnosť alely e2 odďaluje nástup klinických príznakov ochorenia. Genotyp e2/e2 podmieňuje vznik hyperlipoproteinemie typu III, hoci k prejavu sú potrebné ďaľ?ie faktory (diabetes, obezita, hypothyreoidismus, zní?ená tvorba estrogénov). Keď?e u nositeľov alely e4 (u fenotypu e4/e3 sú často zvý?ené hladiny cholesterolu, triglyceridov a zní?ený HDL cholesterol) je zvý?ené aterogénne riziko, indikované ja vy?etrenie izoforiem ApoE aj pri predčasnom aterosklerotickom procese.
Polymorfismus génu pre 5,10 metyléntetrahydrofolát reduktázu - (MTHFR)
Indikácia: homocysteinemie, homocystinúrie s fyziologickými hodnotami metionínu, CHD, poruchy vývoja s motorickými abnormalitami (poruchy chôdze), kŕče
Frekventovaný polymorfismus je spôsobený mutáciou 677C®T v géne pre MTHFR, ktorá vedie k substitúcii alanínu za valín. Mutácia spôsobí termolabilitu enzýmu a nasledne miernu eleváciu hodnôt homocysteinu. Frekvencia polymorfných alele je v európskej populácii 20-30%, pričom homozygotov je pribli?ne 7%. Klinické prejavy, ktoré zahŕňajú motorické abnormality, kŕče a? psychické poruchy závisia od stupňa deficiencie enzýmových aktivít. Homozygoti, u ktorých sú zvý?ené hodnoty homocysteinu, sú pova?ovaní za skupinu so zvý?eným rizikom CHD. V molekulárne-genetickom vy?etrení sa vyu?ívajú metódy PCR a RFLP.
APC resistencia (antikoagulačný proetin C) - mutácia faktoru V Leiden (1691G®A)
Indikácia: tromboembolická choroba, pulmonárna embolisácia, spontánne potraty
Rezistencia faktoru V k antikoagulačnému aktivovanému proteinu C (APC) je najčastej?í jav pozorovaný u pacientov s trombózou, zvlá?ť familiárne podmienenou. U pribli?ne 5% kaukazoidnej populácie dochádza v géne pre koagulačný faktor V k zámene nukleotidu 1691G®A a k nahradeniu arginínu za glutamín (R506Q), čo spôsobuje resistenciu a? neschopnosť APC ?tiepiť túto bielkovinu. Riziko tromboembolickej choroby je pri uvedenej mutácii u heterozygotov pribli?ne 8x vy??ie a u homozygotov a? 80x vy??ie. Mutácie génu pre faktor V spôsobujú taktie? zvý?enie rizika spontánnych potratov. Podstatne zvý?ený je aj výskyt trombóz u tehotných ?ien s APC resistenciou. Molekulárne-genetické vy?etrenie je zalo?ené na metóde PCR a RFLP.
Protrombínový génový variant 20210G®A
Indikácia: tromboembolická choroba
Rizikové faktory trombózy zahŕňajú hereditárne ako aj získané činitele. Mutácie v génoch, ktoré kódujú proteíny ovplyvňujúce koaguláciu, antikoaguláciu alebo fibrinolýzu mô?u zohrávať významnú úlohu v predispozícii trombózy. Okrem častého polymorfizmu faktora V bola zistená aj mutácia v neprekladanej časti génu pre protrombín (20210G®A s frekvenciou alely 0,5-1,8%), ktorá sa javí ako druhý najvýznamnej?í genetický faktor pri vzniku trombóz u kaukazoidnej populácie. Mutácie vedie k zvý?eniu hladiny protrombínu v krvi pravdepodobne tým, ?e sa zvý?i stabilita mRNA, efektívnosť translácie alebo i stabilita samotného proteínu zvý?ením jeho glykozylácie. Zvý?ené hladiny protrombínu predstavujú samostatný rizikový faktor trombózy. U pacientov s diagnostikovanou hlbokou venóznou trombózou prevalencia heterozygotov dosahuje a? 10-20%. Nositelia alely 20210A majú 3-5 násobne vy??ie riziko vzniku venoznej trombózy ne? nositelia be?nej alely. Mutácia 20210G®A protrombínového génu mô?e navy?e taktie? prispievať k zvý?enému riziku tromboembolických stavov u tehotných ?ien.
Cytochrom P-450 CYP2C9 polymorfismus
Indikácia: antikoagulačná terapia warfarínom
Cytochrom P-450 izoforma 2C9 je rozhodujúci enzým v antikoagulačnom efekte warfarínu, nakoľko ukončuje jeho efekt tým, ?e katalyzuje premenu farmakologicky účinnej formy na neaktívne metabolity. Genetický polymorfismus u cytochromu P-450 vedie k tvorbe bielkovinných variantov s rozdielnou katalytickou funkciou. Okrem tzv,.divokého typu alely CYP2C9*1 existujú ďaľ?ie dva alelové varianty - CYP2C9*2 a CYP2C9*3 so zámenou aminokyselín Arg144Cys, resp. Ile359Leu. Katalytická aktivita cytochromu pri druhej alele dosahuje v porovnaní s divokým typom iba 12% a u tretej alely dokona iba 5%. Frekvencia aliel v populácii je nasledovná: 2C9*1 - 84%, 2C9*2 - 11%, 2C9* - 5%. Pri antikoagulačnej terapii warfarínom pacientov ohrozuje krvácanie, ktorého riziko sa zvy?uje so stúpajúcou dávkou a v závislosti od genotypu. Pacienti s variantnými alelami mô?u byť vnímaví na antikoagulačnú terapiu zvlá?ť pri interkurentnej infekcii alebo terapii farmakami, ktoré sú konkurenčne metabolisované cytochromom P-450. Genotypizácie je preto cenná, nielen pre odhalenie rizika krvácania, ale aj pre určenie efektívnej dávky terapie. Predpokladá sa, ?e pacienti homozygotní pre alelu 2C9*3 mô?u byť tak vnímaví na antikoagulačnú terapiu, ?e od terapie warfarinom sa musí upustiť. Molekulárne genetické vy?etrenie pomocou metód PCR a RFLP spoľahlivo určí genotyp pacientov.
Gilbertov syndróm
Indikácia: hyperbilirubinemie so zvý?enou hladinou nekonjugovaného bilirubínu, prolongovaný novorodenecký icterus, hyperbilirubinemie (icterus) spôsobený farmakami.
Gilbertov syndróm je častá poruchav metabolizme bilirubínu, ktorá významne prispieva k vzniku výraznej?ieho a prolongovaného novorodeneckého icteru a u dospelých podmieňuje stav hyperbilirubinemie so zvý?enými hodnotami nekonjugovaného bilirubinu. Gilbertov syndróm mô?e spôsobiť zmeny v glukuronidácii farmák a neočakávanú toxicitu xenobiotík. Molekulárna podstata tohto syndrómu spočíva v polymorfizme nekódujúcej časti génu bilirubin-UDP-glukuronyltransferázy (UGT1A1). Oblasť promótora génu tzv.TATA box sa vyznačuje variabilným počtom tandemových sekvencií (TA)n, pričom be?ne je v géne 6 alebo 7 týchto opakovaní. V európskej populácii je pomer medzi jednotlivými genotypmi UGT1A1 - (TA)6TAA/(TA)6TAA : (TA)6TAA/(TA)7TAA : (TA)7TAA/(TA)7TAA pribli?ne 45:45:10. Gilbertov syndrom s hyperbilirubinemiou zväč?a vy??ou ako 20 umol/l je pritom podmienený prítomnosťou (TA)7TAA alely v homozygotnom stave, kedy je aktivita UGT1 zní?ená na 30%. Molekulárne genetické vy?etrenie je opodstatnené pri objasnení príčiny u prolongovaného novorodeneckého icteru, diferenciálnej diagnostike neobjasnenej hyperbilirubinemie a informácie o genotype by mala byť k dispozícii i u pacientov s predpokladanou dlhodobou terapiou farmakami metabolisovanými prostredníctvom UGT1. Pri Gilbertovom syndróme by mali byť dávky týchto farmák upravené s ohľadom na ich pomaľ?iu glukuronidáciu. V diagnsotike sa vyu?íva PCR s fluorescenčne značeným primerom a nasledná analýza veľkosti vytvorených fragmentov.
Hereditárna hemochromatóza
Indikácia: cirhóza, srdcové zlyhanie, diabetes, splenomegalia, ko?ná pigmentácia, artritis
Hereditárna hemochromatóza je autozomálne recesívne dedičné ochoreniemetabolizmu ?eleza. Pre zlyhanie mechanizmu kontroly absorbcie ?eleza sa nadbytočné ?elezo ukladá do parenchymatóznych orgánov. Gén pre hemochromatózu (HFE) sa nachádza na chromozóme 6 a u európskej populácie sú časté 3 mutácie: 845G®A(C282Y), 187C®G(H63D), 193A®T(S65C). Odhaduje sa, ?e frekvencia heterozygotov s prvou mutáciou je v európe 8-18% a tedy frekvencia homozygotov mô?e byť 0,2-1%. Pribli?ne 24% populácie sú heterozygoti pre mutáciu H63D av?ak homozygoti s touto mutáciou zriedka majú klinické príznaky hemochromatózy. Preto?e hereditárna hemochromatóza je potenciálne letálne ochorenie, molekulárne genetické vy?etrenie umo?ňuje včasnú a spoľahlivú diagnózu ochorenia a tým aj efektívny terapeutický zásah. Metdou PCR a RFLP sa zachytia v?etky tri mutácie, ktoré sa vyskytujú v populácii.
Polymorfismus génu pre jadrový receptor aktivovaný peroxizómovým proliferátorom - PPARg2 (34C®G)
Indikácia: obezita, diabetes mellitus II.typu, inzulínová resistencia, diabetická nefropatia
PPARg2 je jadrový receptor, ktorý reguluje diferenciáciu adipicytov, lipidový metabolismus a inzulínovú senzitivitu. Mutácia v kodóne 12 génu vedie k zámene prolínu za alanín (Pro12Ala). Frekvencia Ala12 v kaukazoidnej populácii je pribli?ne 14%. Polymorfizmus má vzťah k obezite, DM-2 a k inzulínovej resistencii. Popísaný je protektívny efekt Ala12 k diabetickej nefropatii a inzulínvej resistencii. Naopak Pro12Ala polymorfizmus je genetický marker indikujúci riziko perzistujúcej obezity v adolescencii. Molekulárne genetické vy?etrenie polymorfizmu vyu?íva metódy PCR a RFLP.
Defekt myoadenylát deaminázy AMPD1 - detekcia mutácie 34C®T
Indikácia: svalová slabosť, myalgie pri miernej svalovej záťa?i, svalové kŕče
Myoadenylát deamináza 1 (AMPD1) je enzým, ktorého aktivity sú mnohonásobne vy??ie v kostrových svaloch, ne? v ostatných tkanivách. Enzým je spolu s adenylosukcinát syntázou a adenylosukcinát lyázou súčasťou tzv. purínového nukleotidového cyklu Aktivácia tohto cyklu počas svalovej záťa?e vedie k zvý?eniu produkcie energie tým, ?e sa z aminokyselín vytvárajú metabolity citrátového cyklu a stimuluje sa glykolýza. Deficiencia AMPD1 je autozómovo recesívne ochorenie s prejavmi metabolickej myopatie u homozygotov. Diagnostikované AMPD1 deficiencie u kaukazoidnej populácie sú vyvolané zámenou nukleotidu C®T v 2. exóne v pozícii 34 a vznikom stop kodónu, v dôsledku čoho v bunkách zostáva menej ako 2% reziduálnej aktivity enzýmu. Frekvencia mutovanej alely je pomerne vysoká a predstavuje 10-14% u kaukazoidnej populácie. Hoci frekvencia homozygotov v populácii je pribli?ne 2%, nie u ka?dého sa vyvinú príznaky deficiencie. Dôvodom je existencia ďaľ?ích enzýmov AMPD ako aj aletrnatívneho zostrihového miesta u AMPD1 génu, čím sa umo?ní prepis informácie zo zuostávajúcich 14 exónov a syntéza funkčného enzýmu. Molekulárne genetické vy?etrenie je indikované zvlá?ť pri ponámahovej svalovej slabosti a neuromuskulárnych ochoreniach a to u star?ích detí aj u dospelých pacientov. Vy?etrenie plne nahrádza ramenný ischemický test s monitorovaním hladiny amoniaku.
Smith-Lemli-Opitz syndrom (SLOS)
Indikácia: nízke hladiny sérového cholesterolu a GC/MS metódou zistené zvý?ené hodnoty 7-dehydrocholesterolu v sére, charakteristický klinický nález
Incidencia SLOS sa odhaduje na 1:60 000 a? 1:120 000 novonarodených detí. SLOS je autozómovo recesívne ochorenie spôsobené mutáciami génu pre 7-dehydrocholesterol reduktázu (likalizácia 11q12-13). Gén ktorý zaberá 14 kb genómovej DNA je organizobvaný do 9 exónov, pričom 7 exónov kóduje enzýmový protein zlo?ený z 475 aminokyselín. Mutácie génu spôsobujú výrazný deficit aktivít 7-dehydrocholesterol reduktázy s následnou akumuláciou 7 a 8-dehydrocholesterolu (7,8,DHC) a vedú k zní?eniu hodnôt cholesterolu (CH). Biochemická diagnostika zalo?ená iba na meraní hodnôt CH je síce východiskom, ale nieje spoľahlivá. Pribli?ne 10% pacientov má normálne hodnoty CH a keď?e pri enzýmovej metóde určenia CH reaguje aj 7,8DHC, pri výraznom zvý?ení týchto metabolitov mô?u byť namerané fyziologické hodnoty. Z tohto dôvodu pri diagnostike SLOS, zvlá?ť miernych foriem, je potrebné veľkú pozornosť venovať klinickému nálezu, v ktorom mô?u byť nasledovné klinické charakteristiky: mentálna retardácia, mikrocefalia, hypotonia, blefaroptóza, ?iroký koreň nosa, ráz?tep podnebia, malý jazyk, micrognathia, hypospadia, syndaktýlia 2. a 3. prsta nohy, retardovaný rast, katarakta, epikantus. Molekulárne genetickej diagnsotike musí predchádzať biochemická diagnsotika s určením hodnôt CH a 7,8DHC vo vzorkách séra alebo plazmy pomocou GC/MS (labdg. zabezpečuje CLG FNsP Bratislava). Nakoľko mutácie neboli zistené vo v?etkých exónoch, molekulárne genetická diagnsotika je zalo?ená na PCR amplifikácii DNA exónov alebo cDNA (získanej prepisom mRNA izolovanej z leukocytov) a naslednej sekvenčnej analýze amplifikovaných produktov.
Odber materiálu
Izolácia DNA ako aj vy?etrenia sa robia z venoznej krvi a odber nevy?aduje ?iadne ?peciálne podmienky. Do skumavky obsahujúcej 50 ul K2EDTA pridajte 1 ml krvi a dobre premie?ajte. Vhodné je urobiť odber do dvoch skúmaviek. Odber je mo?né uskutočniť aj do jednorázových striekačirk na vy?etrenie krvného obrazu. Transport v priebehu dňa nevy?aduje ?iadne zvlá?tne podmienky.
Pri ochoreniach X-ALD a SLOS je pre diagnostiku potrebné izolovať mRNA minimálne z 5 ml krvi odobratej do EDTA. Transport sa musí uskutočniť do 24 hodín v nezmrazenom stave a vy?etrenie je potrebné telefonicky dohodnúť s CLG FNsP.
V prípade zberu vzoriek viacerých pacientov odobratú krv ulo?te do vymrazovníka a zabezpečte podmienky transportu v zmrazenom stave (zmrazené vzorky sú stabilné po dlhú dobu).
Vy?etrenie viacerých parametrov mo?no uskutočniť vo vzorke z toho istého odberu. Na sprievodný lístok vyplnte po?edované údaje. Výsledok vy?etrenia vám za?leme písomnou formou.
V prípade piotreby ďaľ?ích informácií volate CLG FNsP Bratislava - 02/57290 192.
doc.MUDr.Ján Chandoga, CSc. 02/57290 192
RNDr. Regina Bhulová 02/57290 689
RNDr. Robert Petrovič 02/57290 192
Mgr. Ján Futas 02/57290 192
RNDr. Regina Sepe?iová 02/57290 689